トランスフェリン受容体阻害抗体がＡＮＫＬがん細胞の増殖を抑制 ～肝障害を緩和、新たな治療薬として期待～

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2023年06月07日

【研究発表】

トランスフェリン受容体阻害抗体がＡＮＫＬがん細胞の増殖を抑制

～肝障害を緩和、新たな治療薬として期待～

東海大学［伊勢原キャンパス］医学部先端医療科学の幸谷愛教授は、宮竹佑治特任助教、亀田和明大学院研究学生（当時）、栁谷稜奨励研究員ら、および株式会社ペルセウスプロテオミクスと共に、JST戦略的創造研究推進事業において、アグレッシブＮＫ細胞白血病（ＡＮＫＬ）^注1）が肝臓の類洞毛細血管内で「トランスフェリン」（Ｔｆ）^注2）に依存して増殖することを見いだし、またその受容体であるＴｆＲ１を特異的に阻害する抗体薬ＰＰＭＸ－Ｔ００３がＡＮＫＬに対して顕著な抗腫瘍活性を示すことを発見しました。

本研究成果は、これまで標準治療がなかったＡＮＫＬの治療戦略を劇的に改善できる可能性を秘めており、2023年度から開始予定のＡＮＫＬ患者を対象とした医師主導治験（第Ⅰｂ／Ⅱ相試験）^注3）は、多くの血液内科医や患者から注目を集めています。

本研究成果は、ＡＮＫＬ患者の検体提供（東北大学、秋田大学、名古屋市立大学）、次世代シークエンス解析 ^注4）（群馬大学、和歌山県立医科大学）などの点で多くの機関との共同研究によって得られました。

本研究成果は、米国血液学専門誌「ｂｌｏｏｄ」のオンライン版で公開されました。

 ■研究の背景と経緯

ＡＮＫＬは若年に発症し、発症からの生存期間の中央値はわずか2か月弱と極めて予後不良な血液がんです。年間の発症者数は国内で平均10人前後と大変希少な疾患であり、いまだに標準治療は確立されていません。

いくつかの研究グループが、これまでのＡＮＫＬの症例を解析してその治療成績をまとめた報告（後方視的解析）によると、ＡＮＫＬの生存期間を延伸するには、同種造血幹細胞移植 ^注6）を速やかに実施し、かつ成功させることが必要です。移植を成功するためには、移植の前に実施する抗がん剤治療によってがん細胞を十分に減少させる必要がありますが、現状ではＡＮＫＬに対して「比較的効果が認められる」とされている抗がん剤はＬ－アスパラギナーゼと呼ばれる薬剤のみです。

しかし、この薬剤には時に重篤な肝障害を引き起こすという欠点があります。ＡＮＫＬ患者の多くは、がん細胞によって肝臓に高度なダメージを受けており、治療に必要な量のＬ－アスパラギナーゼに耐えられない状態になっています。そのため、Ｌ－アスパラギナーゼを減量したり、使用そのものを断念したりしなければならず、十分にがん細胞を減少させることができないというジレンマがあります。

そこで、ＡＮＫＬによる肝障害を克服し、移植前に必要な量のＬ－アスパラギナーゼを使用できる環境が整った新たな治療法が必要とされています。そのためには、単純にがん細胞を培地上で試験するだけではなく、実際に肝臓の中にあるがん細胞がどのような形で生存し、増殖しているのかを確認する必要があります。

　近年、ヒトの体内におけるがん細胞と周囲の構造物との間で形成される分子の結合や物質のやり取りを解析する手法として、ヒトと同じ哺乳動物であるマウスの体内にヒトから採取したがん細胞を直接投与して増殖させる、ＰＤＸマウスというツールが発展してきました。多くの場合、ＰＤＸマウス内でのがん細胞の増殖や進展の様式はヒト体内と高度に類似することが分かっており、本研究グループはこの手法を用いてＡＮＫＬのヒト体内、特に肝臓における生存様式を解析し、新薬の治療標的を探索する方針としました。

■研究の内容

まず、ＡＮＫＬ患者3名から採取されたがん細胞を、免疫機能（がん細胞のような異物を排除する能力）を高度に障害する遺伝子改変を施したマウス（免疫不全マウス）に移植し、ＡＮＫＬ ＰＤＸマウスを樹立しました。これらを由来となる患者ごとに、ＡＮＫＬ１、ＡＮＫＬ３、ＡＮＫＬ５と命名しました。これらのマウスを経時的に解剖して各臓器から細胞を抽出し、細胞表面の性質を調べることができるフローサイトメトリー法という技術を用いてがん細胞がどこにいるかを解析すると、がん細胞は初期には肝臓で生着・増殖し、後期に全身の臓器へ広がっていくことが判明しました（図１Ａ）。

肝臓のがん細胞を顕微鏡にて観察すると、肝臓の中でも栄養分やミネラルなどを出し入れする部位である「類洞」と呼ばれる毛細血管の部分で特に増殖していることが分かりました（図１Ｂ）。このことから本研究では、ＡＮＫＬという血液がんは、肝臓でやり取りされている何らかの物質に依存して増殖しているのではないかという仮説を立てました。

続いて、がん細胞と周囲の肝臓の細胞がそれぞれどのような分子を発現・分泌しているかを次世代シークエンサーの技術を用いて網羅的に調べ、その中で肝臓とがん細胞の間で分子同士の結合や物質のやり取りが行われている可能性のある「ペア」を検索しました（図２Ａ）。

その結果、肝臓側で発現するＴｆと、それを受け取るＡＮＫＬ側の受容体分子であるＴｆＲ１のペアが上位にヒットしました（図２Ｂ）。Ｔｆは細胞の増殖や生存に必須の元素である鉄イオンを運搬する輸送体たんぱくであり、主としてＴｆＲ１と結合することで細胞内に取り込まれます。特に、Ｔｆは全身の各臓器の中でも肝臓で最も多く作られていることから、ＡＮＫＬのがん細胞が肝臓類洞内で特に増殖する理由の１つとして、Ｔｆ－ＴｆＲ１のペアを介した鉄イオンの供給を受ける必要があるためと分かりました。

実際に、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系 ^注7）を用いてＡＮＫＬのがん細胞側に発現するＴｆＲ１をノックアウト（無効化）して、ＡＮＫＬ ＰＤＸマウスを樹立したところ、がん細胞が肝臓内での増殖活性を著しく失うことが分かり（図２Ｃ）、ＡＮＫＬは肝臓類洞内で、肝臓側からＴｆを受け取ることで増殖可能となることが確認されました。

そこで、すでにＴｆＲ１に対する阻害抗体を作成していたペルセウスプロテオミクス社（ＰＰＭＸ社）へ共同研究を打診し、実際に阻害抗体ＰＰＭＸ－Ｔ００３がＡＮＫＬに対して有効な治療薬となり得るかを検討しました。まず、ＡＮＫＬ患者３名に由来するがん細胞を、ＰＰＭＸ－Ｔ００３を含んだ培地中で４８時間培養し、生存細胞を測定しました。その結果、がん細胞の生存能はＰＰＭＸ－Ｔ００３の濃度に依存して低下することが判明しました（図３Ａ）。

次に、樹立後7日目のＰＤＸマウスに対してＰＰＭＸ－Ｔ００３を単回静脈内投与し、その後1週間でがん細胞の増殖度合いを、採血によって白血球中のがん細胞割合を見ることで評価しました。その結果、がん細胞は3ミリグラム／キログラム以上のＰＰＭＸ－Ｔ００３を投与したときに顕著にその増殖能の低下を示すことが観察されました（図３Ｂ）。

最後に、実際の治療を想定してＰＰＭＸ－Ｔ００３をＡＮＫＬ ＰＤＸマウスに複数回静脈内投与し、生存期間に差があるかを検討しました。その結果、本研究グループが樹立したＡＮＫＬ ＰＤＸマウスの全てにおいて、治療を行ったマウスは約1.5～2倍の生存期間の延伸を認めました（図４Ａ）。この生存期間の延伸効果は、より症状の進んだＡＮＫＬ ＰＤＸマウス（樹立後14日目）に対して治療を開始しても同様の効果を得ることができました。

続いて、ＰＰＭＸ－Ｔ００３による治療前後で肝臓内のがん細胞の量がどのように変容するかを、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ホタルの光のもとになる遺伝子）を導入したＡＮＫＬ１細胞で樹立したＰＤＸマウスを用いて定量しました。その結果、治療前には肝臓の部位に顕著に発光が認められていましたが、治療を行うと速やかにその発光が消退することが示され、ＰＰＭＸ－Ｔ００３は肝臓で増殖するＡＮＫＬのがん細胞に対して極めて良好な抗腫瘍活性を示すことが判明しました（図４Ｂ）。

■今後の展開

　以上の結果から、ＡＮＫＬの患者が高度な肝障害を発症する要因として、肝臓こそがＡＮＫＬのがん細胞の増殖の場であり、そこにはＴｆ－ＴｆＲ１の相互作用が強く関わっていること、そしてその相互作用を阻害することができるＰＰＭＸ－Ｔ００３はＡＮＫＬに対する新規治療薬としてのポテンシャルを持つことが分かりました。

特に、発病初期に同薬を用いてＡＮＫＬのがん細胞と肝臓の連関を断ち切ることによって肝臓を保護することができれば、引き続いて十分な量のＬ－アスパラギナーゼを含んだ抗がん化学療法をためらいなく行うことが可能となり、結果として同種造血幹細胞移植の前に十分に腫瘍細胞量を減少させ、治療成績の大幅な改善につながることが期待されます。

　本研究グループは、この成果に基づいて、2023年度中に東海大学、東北大学、岡山大学、京都大学、九州大学および広島大学においてＡＮＫＬ患者を対象としたＰＰＭＸ－Ｔ００３の有効性と安全性を検討する医師主導治験（第Ⅰｂ／ＩＩ相試験）を開始する予定です。今後はこの医師主導治験を滞りなく進めていくとともに、ＡＮＫＬの鉄依存度の高さを裏付ける病態生理について、さらなる解析を進めていきます。

■参考図

図１：ＡＮＫＬのがん細胞は主として肝臓類洞内で増殖する

（Ａ）ＡＮＫＬ１のＰＤＸマウス樹立後の日数と、各臓器に存在する腫瘍細胞量。がん細胞は最初に肝臓（Ｌｉｖｅｒ）で増殖し、その後全身の各臓器（骨髄；ＢＭ、脾臓；Ｓｐｌｅｅｎ、末梢血；ＰＢ）に広がっていくことが分かった。（Ｂ）ＡＮＫＬ１の肝臓の顕微鏡所見。上は一般的な染色で、下はＡＮＫＬのがん細胞をＥＢＥＲと呼ばれる核酸分子を染める（ＥＢＥＲ－ＩＳＨ）ことで、茶色に標識したもの。ＡＮＫＬは肝細胞の間を網目状にめぐる類洞と呼ばれる毛細血管内で増殖することが分かった。

図２：ＡＮＫＬのがん細胞は肝臓から分泌されるＴｆに依存して増殖する

（Ａ、Ｂ）次世代シークエンサーによって肝臓とＡＮＫＬ１のがん細胞それぞれが発現している分子を網羅的に解析し、それらの中で分子同士が結合する「ペア」をＨｕＲＩ（Ｈｕｍａｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ）と呼ばれるデータベースを用いて抽出した。この中で、治療標的となり得る分子について絞り込みを行ったところ、Ｔｆ－ＴｆＲ１の分子結合が同定された。（Ｃ）ＴｆＲ１をノックアウトしたＡＮＫＬ１細胞（ｓｇＴＦＲＣ）は、ノックアウトされていない細胞（ｓｇＮＴ）と比較して肝臓内で増殖する腫瘍細胞の割合が著しく低下した。

図３：ＰＰＭＸ－Ｔ００３はＡＮＫＬのがん細胞の増殖を濃度依存的に抑制する

（Ａ）3つのＡＮＫＬ患者由来細胞を培地中でＰＰＭＸ－Ｔ００３存在下で培養し、48時間後の生存細胞数を測定した。いずれの細胞も濃度依存性に生存能が低下することが示された。（Ｂ）ＡＮＫＬ１ ＰＤＸマウスに対して樹立後7日目にＰＰＭＸ－Ｔ００３を単回静脈内投与し、樹立後11日目、14日目に採血を行い、白血球中のがん細胞の割合を測定した。ＰＰＭＸ－Ｔ００３ 3ミリグラム／キログラム以上の投与によってがん細胞の量は著減することが示された。

図４：ＰＰＭＸ－Ｔ００３によってＡＮＫＬ ＰＤＸマウスの肝臓からがん細胞が消退し、生存期間が延伸した

（Ａ）3つのＡＮＫＬ ＰＤＸマウスに対してＰＰＭＸ－Ｔ００３または有効成分の入っていない緩衝液（ＰＢＳ）を樹立後5、8、12、15日目に、各10ミリグラム／キログラムを静脈内投与して生存期間を解析した。その結果、ＰＰＭＸ－Ｔ００３による治療群（赤）は未治療群（青）と比較して顕著に生存期間が延伸することが判明した。（Ｂ）ホタルルシフェラーゼ遺伝子を導入したＡＮＫＬ１細胞を用いて、がん細胞を発光させた状態でＰＰＭＸ－Ｔ００３ 10ミリグラム／キログラムの静脈内投与による治療をＰＤＸマウス樹立後14日目、17日目、21日目、24日目に行い、経時的にがん細胞の量を確認した。投与後速やかに肝臓からがん細胞を示す発光は消退した。

 ■用語解説

注1）アグレッシブＮＫ細胞白血病（Ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ＮＫ ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ；ＡＮＫＬ）

血液がんの一種。ナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ；ＮＫ ｃｅｌｌ）と呼ばれるリンパ球の一種ががん化したもの。

注2）トランスフェリン（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ；Ｔｆ）

Ｔｆは、細胞の生命活動に必須の元素である鉄イオンを体中の臓器へ届けるための輸送たんぱくである。Ｔｆの受容体であるトランスフェリン受容体１（Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ１；ＴｆＲ１）は、鉄イオンを受け取る細胞がその表面に発現するたんぱくであり、鉄イオンを運んでいるＴｆがＴｆＲ１に結合すると、ＴｆＲ１はＴｆごと細胞内へ取り込まれ、鉄イオンを受け取る。

注3）医師主導治験

新薬のヒトに対する安全性と有効性を確かめる試験（治験）を、製薬会社ではなく医師が主導して行うもの。通常全部で3つのフェーズに分けられ、第Ⅰ相では主として安全性や薬物動態、第Ⅱ相では患者に対する有効性、第Ⅲ相では既存の治療薬による治療との比較（二重盲検無作為化比較試験）を行う。

注4）次世代シークエンサー

サンプル中の細胞に存在する遺伝子変異や、それぞれの遺伝子がどのように発現しているかといった情報を、網羅的に（全ゲノムレベルで）解析できる技術。今回の解析では、がん細胞と肝臓の細胞がどのような遺伝子を発現しているかという情報について、次世代シークエンサーの中でも「ＲＮＡｓｅｑ」という手法を用いて解析した。

注5）患者由来異種移植マウス（Ｐａｔｉｅｎｔ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ　ｍｏｕｓｅ；ＰＤＸマウス）

患者から採取した腫瘍細胞を、あらかじめ免疫機能（外から入り込んだ異物を排除する機能）を排除するための特別な遺伝子操作を行ったマウス（免疫不全マウス）に投与（今回の場合は静脈注射）することで樹立する。患者の腫瘍はマウスの体内で、患者の体内での増殖や進展様式を高度に再現することができ、より詳細な腫瘍細胞と周囲の構造体との相互作用を解析することが可能となる。

注6）同種造血幹細胞移植

一般的には「骨髄移植」という言葉で知られる。多くの血液がんを根治せしめる治療法。あらかじめ致死量の放射線照射や大量の抗がん剤治療を行うことにより、自分の血を作る細胞（造血幹細胞）を死滅させ、その状態で健康なドナーの造血幹細胞を投与し、がんを発症するような異常のないきれいな血を作る能力を獲得する治療。一方で合併症も多く、移植前に十分に病勢をコントロールできなければ成功率は低下する。

注7）ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９系

大腸菌が持つ免疫機構を基盤とした遺伝子改変技術。もともとは大腸菌の菌体内に侵入したウイルスなどの遺伝子を、それを認識する小ガイドＲＮＡに誘導されたカスパーゼ９　（Ｃａｓ９）という核酸分解酵素が分解するシステムを指す。このシステムを応用して、対象の遺伝子（今回はＴｆＲ１をコードするＴＦＲＣ遺伝子）を認識する小ガイドＲＮＡとＣａｓ９を同時に細胞内（今回はＡＮＫＬがん細胞）に導入することで、対象遺伝子（ＴＦＲＣ遺伝子）にダメージ（変異）を与え、遺伝子発現ができないノックアウト細胞を作ることができる。

■論文タイトル

"Hepatic niche leads to aggressive natural killer cell leukemia proliferation through transferrin-transferrin receptor 1 axis"

（肝臓微小環境は、トランスフェリン－トランスフェリン受容体1の相互作用を介してアグレッシブＮＫ細胞白血病の増殖を誘導する）

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