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リンパ腫における細胞外小胞を介した新規発がんメカニズムを発見 ～脂質を軸とした新たな治療法の開発に期待～
2022年03月15日
ポイント
リンパ腫では、「細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ：ＥＶ）」注１）を介した腫瘍と腫瘍微小環境注２）での相互作用により腫瘍形成が促進されるが、その詳細は不明であった。
腫瘍微小環境において、腫瘍由来ＥＶはリン脂質分解酵素「ｓＰＬＡ２」により分解され、その分解産物である脂質が腫瘍形成を促進するという新規メカニズムが明らかになった。
リンパ腫の発生および悪性化につながる「ｓＰＬＡ２－ＥＶ軸」という新たな免疫チェックポイントをターゲットとした新規治療法の開発が期待できる。
ＪＳＴ 戦略的創造研究推進事業およびＡＭＥＤ 次世代がん事業などにおいて、東海大学 医学部の幸谷 愛（コウタニ アイ） 教授および東京大学 大学院医学系研究科の村上 誠（ムラカミ マコト） 教授は、東海大学 大学院医学研究科の工藤 海（クドウ カイ） 大学院生、東京大学 大学院医学系研究科の三木 寿美（ミキ ヨシミ） 特任研究員らとともに、リンパ腫の発生や悪性化における細胞外小胞（ＥＶ）の新規作動メカニズムを発見しました。
東海大学 幸谷グループでは、これまでにＥｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）注３）陽性Ｂ細胞性悪性リンパ腫の発症におけるＥＶの役割を調査してきましたが、その作動メカニズムの全容は明らかになっていませんでした。一方、東京大学 村上グループでは、これまでに細胞外環境に存在するリン脂質注４）分解酵素「分泌型ホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２）注５）」が関与する数多くの生命現象を明らかにしてきましたが、実際にｓＰＬＡ２が細胞外で基質としているリン脂質の供給源は不明でした。
本研究では、悪性リンパ腫組織中の腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）注６）から分泌されるｓＰＬＡ２が腫瘍細胞由来ＥＶのリン脂質を分解することを証明しました。さらに、この分解により「細胞への取り込まれやすさ」や「免疫抑制効果」などのＥＶの機能が飛躍的に向上し、さまざまな生命現象が誘導されることが分かりました。このとき、ＥＶリン脂質の分解産物であるリゾリン脂質などが細胞にシグナルを伝達しているという、これまでのＥＶ生物学にはない新規作動メカニズムを介することを発見しました。そして本研究グループはヒトにおけるリンパ腫発生を再現したモデルマウスを使って、ｓＰＬＡ２によるＥＶ分解が腫瘍形成において必要不可欠であることを証明しました。また実際のヒト患者検体の解析からもｓＰＬＡ２が腫瘍形成と悪性化に関わることを示しました。
一方で、本研究ではリンパ腫由来ＥＶのみならず他のがん細胞由来ＥＶもｓＰＬＡ２により分解されることを証明し、ｓＰＬＡ２－ＥＶ軸は腫瘍形成において共通の現象であることを明らかにしました。今後はこのｓＰＬＡ２－ＥＶ軸が新たな「免疫チェックポイント」として、がん治療のための新しい薬物標的となることが期待されます。また本研究で証明されたｓＰＬＡ２によるＥＶ機能の増強効果から、過去に幸谷グループで報告した「組織保護・抗炎症作用を持つＥＶ」などのさまざまな種類のＥＶが持つ固有の能力をｓＰＬＡ２が増強するのではないかという仮説の検証も現在行っており、今後は治療的応用への発展も期待されます（特許出願中）。
本研究は、東海大学 血液腫瘍内科の安藤 潔 教授、東海大学 病理診断学の中村 直哉 教授、Ｊｏａｑｕｉｍ Ｃａｒｒｅｌｕｓ 講師、東北大学の井上 飛鳥 准教授、徳島大学の山本 圭 准教授、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ／Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌの樋口 廣士 研究員、滋賀医科大学の森田 真也 教授、東京大学 大学院薬学系研究科の青木 淳賢 教授らを含む複数機関との共同研究によって得られました。
本研究成果は、２０２２年３月１５日午前１１時（米国東部時間）に米国科学誌「Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」のオンライン版で公開されます。
＜研究の背景と経緯＞
がんの発症や悪性化には、炎症の制御が深く関与しています。中でも炎症反応が長引くことで構築される腫瘍微小環境は、腫瘍形成において極めて重要な役割を担うと考えられています。東海大学 幸谷グループでは、これまでにＥｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）陽性Ｂ細胞性悪性リンパ腫の発症に関する研究から、ウイルス由来遺伝物質を運ぶ細胞外小胞（ＥＶ）がリンパ腫悪性化のカギであることを証明してきました［Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２０１８；１３１（２３）］。しかしそのウイルス由来遺伝物質のみでは悪性化が誘導されないことから、ＥＶを構成するリン脂質に着目し、その分子内には抗炎症性脂質であるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などの多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）が多く含まれるということを明らかにしました。ＰＵＦＡは機能性脂質「脂質メディエーター注７）」の前駆体であり、通常はリン脂質に結合した状態で存在しますが「分泌型ホスホリパーゼＡ₂（ｓＰＬＡ₂）」がこれをリン脂質から切り離すことで脂質メディエーター合成を開始させることが知られています。
一方で近年、炎症やがんにおいては脂質メディエーターの関与が大きいことが知られており、さまざまな疾患へのｓＰＬＡ₂群の関与が注目されています。そこで「ｓＰＬＡ₂がＥＶ膜上リン脂質に作用することで脂質メディエーターが生成され、腫瘍微小環境に多大な影響を及ぼしている」との仮説を立て、ｓＰＬＡ₂研究で国内随一の実績を持つ東京大学 村上グループとの共同研究を行いました。ＥＶを介した物質の輸送に関しては世界中で多くの研究が報告されていますが、その実験系構築の難しさや脂質という領域の複雑さからＥＶの膜脂質に着目した研究はごくわずかです。そのような中で、本研究グループは上記の仮説をもとに、「実際に腫瘍由来ＥＶがｓＰＬＡ２の基質となり得るのか」を皮切りに、両研究グループの強みを生かして、詳細な脂質解析、その生物学的意義および腫瘍形成に及ぼす影響について検討を進めました。
＜研究の内容＞
本研究では、まず血中の免疫細胞をヒトの細胞に置き換えたヒト化マウス注８）を作成し、ＥＢＶを感染させることでマウスにヒトのリンパ腫を自然発生させました。幸谷グループの属する東海大学では、このヒト化マウスモデルを国内最初に作成した実績があり、安定的に作成できました。この腫瘍モデルマウスの腫瘍組織内で発現するｓＰＬＡ２を解析したところ、ｓＰＬＡ２群の中でも強力な活性を持つ「ｓＰＬＡ２－Ｘ」が腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）に高発現していることが明らかとなりました（図１）。
そこでそのｓＰＬＡ２－Ｘと腫瘍由来ＥＶを試験管内で反応させたところ、大量のリン脂質分解産物が検出され、腫瘍由来ＥＶがｓＰＬＡ２に分解されることが証明されました（図１）。またこのときのＥＶを「クライオ電子顕微鏡」で観察したところ、この反応によりＥＶの形状が著しく変化することが世界で初めて観察されました（図２）。
次にそのｓＰＬＡ₂処理ＥＶ（ｓＰＬＡ₂ ＥＶ）の機能についてさまざまな側面からの解析を行いました。その結果、
① ＥＶの古典的作動メカニズムであるマクロファージへの取り込みが促進される
② マクロファージにおけるＴＡＭマーカー発現が著しく増加する
③ 酵素反応によりＥＶから生成される脂質メディエーター分子そのものも①・②の機能を促進する
④ ｓＰＬＡ₂の酵素反応は腫瘍細胞由来・患者血清由来のＥＶで起こり、健常者血清由来のＥＶでは影響が小さい
ことを含むさまざまな現象が明らかとなりました。
一方で、この酵素反応により生成される脂質メディエーターは細胞膜上の「Ｇたんぱく質共役受容体（ＧＰＣＲ）注９）」を活性化することで効果を発揮することが知られています。
ｓＰＬＡ₂ ＥＶでは上記の知見から脂質メディエーターによるＧＰＣＲの活性化の可能性が考えられたため、東北大学 井上 飛鳥 准教授、東京大学 大学院薬学系研究科 青木 淳賢 教授が開発した「ＴＧＦα Ｓｈｅｄｄｉｎｇ ａｓｓａｙ［Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１２；９］」を用いて解析を行ったところ、ＥＶを取り込む能力のある単球様細胞株ＴＨＰ－１だけでなくＥＶを取り込む能力の無いＴリンパ球系細胞株であるＪｕｒｋａｔでもｓＰＬＡ２ ＥＶによるシグナル増強が確認されました。これは「ＥＶは細胞に取り込まれずとも作用する」というこれまでのＥＶ生物学にはない新規の作動メカニズムが存在することを意味しており、これにより生体内ではｓＰＬＡ２によってＥＶのターゲット層が大幅に拡大し、さまざまな細胞に影響し得ると考えられます（図３）。
次に本研究グループは、そのｓＰＬＡ２ ＥＶの効果を生体において実証するため、炎症モデルマウスにｓＰＬＡ２ ＥＶを投与することで、リンパ腫由来ＥＶが本来持っている抗炎症・免疫抑制効果がｓＰＬＡ２によって増強されるかを検討しました。その結果、脾臓（ひぞう）や肺におけるさまざまな抗炎症効果の増強が認められました（図４）。
さらに本研究グループはＥＢＶ感染腫瘍形成モデルでの検討も行いました。前述の先行研究においては、腫瘍由来ＥＶを投与すると腫瘍形成が促進されるということが報告されていましたが、本研究では通常の腫瘍由来ＥＶではなくｓＰＬＡ２ ＥＶを投与したところ、劇的な腫瘍形成促進効果が確認されました（図４）。また、生体内に存在するｓＰＬＡ２を阻害剤によって抑制すると腫瘍形成が完全に抑制されました。
最後にこの現象が実際にヒトでも起こっているのか検討するために、東海大学医学部付属病院で過去にびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫注１０）と診断された患者の腫瘍組織検体全１００例を用いてヒト腫瘍組織におけるｓＰＬＡ２の発現の有無を調査しました。その結果、ｓＰＬＡ２－Ｘ陽性の患者では悪性度の指標となるバイオマーカーが陰性群より高値を示し、臨床病期も高い傾向が見られ、予後も不良であることが明らかとなりました。
以上の結果をまとめると、腫瘍形成においては腫瘍組織中のＴＡＭより細胞外リン脂質分解酵素ｓＰＬＡ２が分泌されており、これにより腫瘍細胞から分泌されたＥＶの膜リン脂質が分解されると、さまざまな脂肪酸やリゾリン脂質が生成され、ＥＶの形態変化・ＧＰＣＲシグナル増強・取り込みの促進などが誘導され、結果的には腫瘍微小環境の構築が急激に促進され腫瘍形成へとつながることが明らかになりました。一方でこのｓＰＬＡ２－ＥＶ軸を阻害するｓＰＬＡ２阻害剤の投与で腫瘍形成が抑制されたことから、がん治療の新規創薬ターゲットとなることが期待されます（図５）。
＜今後の展開＞
本研究から、悪性リンパ腫の発生および悪化におけるカギ「ｓＰＬＡ２－ＥＶ軸」という新たな免疫チェックポイントの存在が明らかになったことより、今後はリンパ腫組織中のｓＰＬＡ２をターゲットとしたリンパ腫治療薬の開発やバイオマーカーとしての活用などが望まれます。また、ＥＶ膜リン脂質の分解は、他のがん由来のＥＶにおいても起こることが証明されたことから、ｓＰＬＡ２－ＥＶ軸をターゲットとした治療は全がんにおいて有効である可能性も秘めており、今後のさらなる研究が期待されます。
一方でｓＰＬＡ２ が示したＥＶの機能向上効果を治療目的に応用する試みも進められており、幸谷グループでは組織保護作用・抗炎症作用を持つヒト肝細胞由来のＥＶにおいてｓＰＬＡ２がその組織保護・抗炎症効果を飛躍的に向上させることを確認しています。このようにｓＰＬＡ２－ＥＶ軸は腫瘍形成の枠にとどまらず、ｓＰＬＡ２がＥＶの固有の能力を増強するという点でこの特殊なｓＰＬＡ２－ＥＶ代謝物を「ｓＰＬＡ２ Ｒｅａｃｔｅｄ ＥＶ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ；ＳＰＲＥＤｓ」と名付け（特許出願中）、現在は新型コロナウイルス感染症を模した重症肺炎モデルにおける治療効果に重点を置いた検討が進められています。最終的にはＳＰＲＥＤｓを用いた全身性に有効な抗炎症薬の開発につながることが期待されます。
ＥＢＶ陽性リンパ腫モデルマウスで発生した腫瘍組織中のｓＰＬＡ２発現を解析した。脾臓で発生したリンパ腫組織ではＰＬＡ２Ｇ１０＝ｓＰＬＡ２－Ｘが正常脾臓組織；ＥＢＶ（－）に比べて最も高発現だった（図1-1）。また同腫瘍組織の多重免疫染色の結果、ＰＬＡ２Ｇ１０＝ｓＰＬＡ２－ＸはＣＤ１６３陽性細胞＝Ｍ２型マクロファージに発現が認められた（図1-2）。このタイプのマクロファージは免疫抑制型の形質を示すことが知られており、腫瘍細胞に対する周りの免疫細胞の攻撃を抑制する方向に働き、がんの進行を促進する。ゆえに腫瘍随伴マクロファージ（Ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ；ＴＡＭ）とも呼ばれ、腫瘍微小環境の構築に大きな影響を与えることが分かっている。
発現増加が見られたｓＰＬＡ２をＥＢＶ陽性リンパ腫細胞から分泌されたＥＶ（Ａｋａｔａ ＥＶｓ）と試験管内で反応させ、質量分析装置にてリン脂質分解産物を検出した。その結果、ｓＰＬＡ２－Ｘと反応させた場合に分解産物の検出量が増加し、ＥＶが分解されていることが証明された。しかし対照実験のｓＰＬＡ２－ＩＩＤではそのような変化は見られず、少なくともこの条件下では酵素活性を示さなかった（図1-3）。
（図2）ｓＰＬＡ２－Ｘと反応直後に最新技術である「クライオ電子顕微鏡」で形態変化を観察した。この結果、脂質２重膜の内層と外層の間隔が不均一となるような形態（黄色矢印）、いびつな形態（紫色矢印）、ＥＶ膜の一部欠損（赤色矢印）、さらにはＥＶ同士の融合とそれによる数珠つなぎ状の凝集（ピンク矢印、ピンク円）が高頻度に観察された。ＥＶの融合により個々のＥＶの中身は多数のＥＶとで共有され、マクロファージに取り込まれる際には効率よくＥＶの中身が取り込まれることで、通常のＥＶの何倍も強力な影響を与える可能性が示唆された。
（図3）ｓＰＬＡ２処理されたＥＶでは膜融合により複数のＥＶ内包物が一度に取り込まれる（古典的作動メカニズムの強化）。またｓＰＬＡ２処理により発生した分解産物であるリゾリン脂質や脂質メディエーターは細胞膜上のＧＰＣＲを介してシグナルを伝達する。マクロファージにおいては両方の作動メカニズムを介して強力なシグナルが入りＴＡＭ誘導が促進される。他の免疫細胞などでもＥＶの取り込みはできないもののＧＰＣＲシグナルによりさまざまな生命現象を引き起こす。
（図4）マウスに炎症を誘導するため大腸菌由来の毒素リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を用いた。このＬＰＳの投与により白脾髄領域（紫色の濃い類円形領域）が増大したが、ｓＰＬＡ２ ＥＶの投与によりそれがほとんど打ち消された（①）。また、この抗炎症効果を肺でも同様に評価したところ、ＬＰＳ投与により肺胞腔の領域に好中球等免疫細胞が著しく増加したが、これもｓＰＬＡ２ ＥＶの投与で打ち消され、ｓＰＬＡ２ ＥＶの全身性に有効かつ強力な抗炎症（免疫抑制）効果が証明された（②）。
次に、そのｓＰＬＡ２ ＥＶを造血系ヒト化マウスを用いたＥＢＶ陽性リンパ腫モデルに投与した時の腫瘍形成促進効果（③）とｓＰＬＡ２阻害時の腫瘍形成への影響（④）を評価した。腫瘍形成促進効果を評価する際には、低力価の感染では腫瘍形成を引き起こさないＥＢＶであるＢ９５－８株を感染させ、そこへｓＰＬＡ２ ＥＶなどを投与した。このときＥＶ投与により腫瘍形成は見られたものの、ｓＰＬＡ２ ＥＶ投与時にはそれよりも急速に腫瘍が形成された。一方で腫瘍組織におけるｓＰＬＡ２阻害効果を評価する際には、感染のみで腫瘍形成を引き起こすＥＢＶであるＡｋａｔａ株を感染させた。このときｓＰＬＡ２阻害剤はウイルス感染時より浸透圧ポンプを体内に留置することで観察している間持続的に投与した。この結果ｓＰＬＡ２阻害により腫瘍形成が完全に抑制された。
＜用語解説＞
注１）細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶ）
細胞から放出される核を持たない脂質２重膜で囲まれた粒子。がん研究の分野では、ＥＶがさまざまなたんぱく質や核酸を輸送することで、がんの生存や悪性化を促す働きが注目を集めている。
注２）腫瘍微小環境
がん細胞（腫瘍）の周囲を囲む環境のこと。正常組織や免疫細胞、細胞外マトリックス、血管などから構成される。微小環境から腫瘍が栄養の供給を受けるなど、腫瘍と微小環境は相互に影響を及ぼし合っており、微小環境が腫瘍の縮小や増殖にも影響を及ぼすと考えられている。
注３）Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）
２本鎖ＤＮＡをゲノムとして持つヘルペスウイルスの一種。ＥＢＶ関連疾患の多くは悪性リンパ腫などの血液腫瘍だが、まれに胃がんなどの上皮細胞がんも引き起こすことが知られている。本研究課題では腫瘍形成能の強いＡｋａｔａ株とそれに比べて弱いＢ９５－８株の２種類のウイルス株を用いた。
注４）リン脂質
コリンやセリンなどの親水性の分子と疎水性を示す２本の脂肪酸を持つ両親媒性の脂質。細胞膜や細胞外小胞の膜などの生体膜の主要な構成成分として知られている。また親水性分子の種類と２本の脂肪酸の種類からその組み合わせは無数にあり、膨大な数の分子種が存在することが明らかになっている。
注５）分泌性ホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２）
リン脂質に結合する２本の脂肪酸のうちｓｎ－２位と呼ばれる部位には不飽和脂肪酸を結合していることが多いが、ｓＰＬＡ２はその部分を切断しリン脂質から脂肪酸とリゾリン脂質を遊離する酵素である。遊離された脂肪酸とリゾリン脂質は強力な脂質メディエーター注７）へと変換されることが知られていることから、ｓＰＬＡ２は脂質メディエーター合成の律速因子であるとされている。生体においてｓＰＬＡ２はリンパ組織におけるオメガ（ω）－３脂肪酸の遊離を介した獲得免疫へのブレーキや（ｓＰＬＡ₂－ＩＩＤ）、気道上皮における自然免疫リンパ球ＩＬＣ２の活性化促進によるぜんそくの悪化（ｓＰＬＡ₂－Ｘ）など、それぞれ異なる組織分布と基質選択性を示すことで組織固有の生命応答を引き起こすことが知られている。
注６）腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）
マクロファージとは体の中に侵入してきたウイルスや細菌など異物の排除に関与する重要な免疫細胞の１つであり、腫瘍随伴マクロファージは腫瘍組織に浸潤しているマクロファージの総称。主に免疫抑制型の形質を示すＭ２型マクロファージがこれに含まれる。そのため、この細胞の浸潤した腫瘍組織では正常な抗腫瘍免疫が抑制され、腫瘍の進展が促進されることが知られている。
注７）脂質メディエーター
不飽和脂肪酸やリゾリン脂質から派生する機能性脂質で、生理活性脂質とも呼ばれる。一般的にはプロスタグランジンやロイコトリエンなどが有名であり、生体内においては炎症を促進する効果を持つオメガ（ω）－６系脂肪酸（アラキドン酸など）に由来する脂質メディエーターと、反対に炎症を鎮める効果を持つω－３系脂肪酸（ドコサヘキサエン酸など）が互いに拮抗（きっこう）することで、正常な生命活動のバランスが保たれている。一方、リゾリン脂質性の脂質メディエーターとしてはリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が知られている。脂質メディエーターのほとんどはＧＰＣＲを介してシグナルを伝達する。
注８）造血系ヒト化マウス
重症免疫不全マウス（ＮＯＤ／ｓｈｉ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ＲγＫＯマウス）にヒト臍帯（さいたい）血由来の造血幹細胞を移植したマウス。マウス生体内に生着したヒト造血幹細胞からヒトの血液細胞が再構築されるため、ヒトの造血研究などで有用なツールとして用いられている。
注９）Ｇたんぱく質共役型受容体（ＧＰＣＲ）
細胞膜上に存在する膜貫通型の受容体で、その種類は数百種類にもおよぶ。現在出回っている薬剤の多くがこのＧＰＣＲを介して機能することが知られており、創薬における重要な標的分子であるとされている。
注１０）びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）
Ｂ細胞性悪性リンパ腫の一種。日本においては最も頻度の高い悪性リンパ腫であり、リンパ腫全体のおよそ３０パーセント程度を占めることが知られている。
＜論文タイトル＞
“Secreted phospholipase A2 modifies extracellular vesicles and accelerates B-cell lymphoma”
（分泌性ホスホリパーゼＡ２は細胞外小胞を修飾しＢ細胞リンパ腫形成を促進する）
＜お問い合わせ先＞
＜研究に関すること＞
幸谷 愛（コウタニ アイ）
東海大学医学部 基盤診療学系 先端医療科学 教授
〒259-1193 神奈川県伊勢原市下糟屋１４３
Tel：0463-93-1121(内線2781)
E-mail：aikotani@k-lab.jp
村上 誠（ムラカミ マコト）
東京大学 大学院医学系研究科 教授
〒113-8655 東京都文京区本郷７－３－１
TEL：03-5841-1431
E-mail：makmurak@m.u-tokyo.ac.jp
＜ＪＳＴ事業に関すること＞
保田 睦子（ヤスダ ムツコ）
科学技術振興機構 戦略研究推進部 ライフイノベーショングループ
〒102-0076 東京都千代田区五番町７ Ｋ’s五番町
Tel：03-3512-3524 Fax：03-3222-2064
E-mail：crest@jst.go.jp
＜報道担当＞
科学技術振興機構 広報課
〒102-8666 東京都千代田区四番町５番地３
Tel：03-5214-8404 Fax：03-5214-8432
E-mail：jstkoho@jst.go.jp
東海大学 広報担当 喜友名 浩史（キユナ ヒロシ）
〒259-1292 神奈川県平塚市北金目４－１－１
Tel：0463-58-1211（代表）
E-mail：pr@tsc.u-tokai.ac.jp
東京大学 医学部・医学系研究科 総務担当
〒113-0033 東京都文京区本郷7-3-1
Tel：03-5841-3304
リンパ腫では、「細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅ：ＥＶ）」注１）を介した腫瘍と腫瘍微小環境注２）での相互作用により腫瘍形成が促進されるが、その詳細は不明であった。
腫瘍微小環境において、腫瘍由来ＥＶはリン脂質分解酵素「ｓＰＬＡ２」により分解され、その分解産物である脂質が腫瘍形成を促進するという新規メカニズムが明らかになった。
リンパ腫の発生および悪性化につながる「ｓＰＬＡ２－ＥＶ軸」という新たな免疫チェックポイントをターゲットとした新規治療法の開発が期待できる。
ＪＳＴ 戦略的創造研究推進事業およびＡＭＥＤ 次世代がん事業などにおいて、東海大学 医学部の幸谷 愛（コウタニ アイ） 教授および東京大学 大学院医学系研究科の村上 誠（ムラカミ マコト） 教授は、東海大学 大学院医学研究科の工藤 海（クドウ カイ） 大学院生、東京大学 大学院医学系研究科の三木 寿美（ミキ ヨシミ） 特任研究員らとともに、リンパ腫の発生や悪性化における細胞外小胞（ＥＶ）の新規作動メカニズムを発見しました。
東海大学 幸谷グループでは、これまでにＥｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）注３）陽性Ｂ細胞性悪性リンパ腫の発症におけるＥＶの役割を調査してきましたが、その作動メカニズムの全容は明らかになっていませんでした。一方、東京大学 村上グループでは、これまでに細胞外環境に存在するリン脂質注４）分解酵素「分泌型ホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２）注５）」が関与する数多くの生命現象を明らかにしてきましたが、実際にｓＰＬＡ２が細胞外で基質としているリン脂質の供給源は不明でした。
本研究では、悪性リンパ腫組織中の腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）注６）から分泌されるｓＰＬＡ２が腫瘍細胞由来ＥＶのリン脂質を分解することを証明しました。さらに、この分解により「細胞への取り込まれやすさ」や「免疫抑制効果」などのＥＶの機能が飛躍的に向上し、さまざまな生命現象が誘導されることが分かりました。このとき、ＥＶリン脂質の分解産物であるリゾリン脂質などが細胞にシグナルを伝達しているという、これまでのＥＶ生物学にはない新規作動メカニズムを介することを発見しました。そして本研究グループはヒトにおけるリンパ腫発生を再現したモデルマウスを使って、ｓＰＬＡ２によるＥＶ分解が腫瘍形成において必要不可欠であることを証明しました。また実際のヒト患者検体の解析からもｓＰＬＡ２が腫瘍形成と悪性化に関わることを示しました。
一方で、本研究ではリンパ腫由来ＥＶのみならず他のがん細胞由来ＥＶもｓＰＬＡ２により分解されることを証明し、ｓＰＬＡ２－ＥＶ軸は腫瘍形成において共通の現象であることを明らかにしました。今後はこのｓＰＬＡ２－ＥＶ軸が新たな「免疫チェックポイント」として、がん治療のための新しい薬物標的となることが期待されます。また本研究で証明されたｓＰＬＡ２によるＥＶ機能の増強効果から、過去に幸谷グループで報告した「組織保護・抗炎症作用を持つＥＶ」などのさまざまな種類のＥＶが持つ固有の能力をｓＰＬＡ２が増強するのではないかという仮説の検証も現在行っており、今後は治療的応用への発展も期待されます（特許出願中）。
本研究は、東海大学 血液腫瘍内科の安藤 潔 教授、東海大学 病理診断学の中村 直哉 教授、Ｊｏａｑｕｉｍ Ｃａｒｒｅｌｕｓ 講師、東北大学の井上 飛鳥 准教授、徳島大学の山本 圭 准教授、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ／Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌの樋口 廣士 研究員、滋賀医科大学の森田 真也 教授、東京大学 大学院薬学系研究科の青木 淳賢 教授らを含む複数機関との共同研究によって得られました。
本研究成果は、２０２２年３月１５日午前１１時（米国東部時間）に米国科学誌「Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ」のオンライン版で公開されます。
＜研究の背景と経緯＞
がんの発症や悪性化には、炎症の制御が深く関与しています。中でも炎症反応が長引くことで構築される腫瘍微小環境は、腫瘍形成において極めて重要な役割を担うと考えられています。東海大学 幸谷グループでは、これまでにＥｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）陽性Ｂ細胞性悪性リンパ腫の発症に関する研究から、ウイルス由来遺伝物質を運ぶ細胞外小胞（ＥＶ）がリンパ腫悪性化のカギであることを証明してきました［Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２０１８；１３１（２３）］。しかしそのウイルス由来遺伝物質のみでは悪性化が誘導されないことから、ＥＶを構成するリン脂質に着目し、その分子内には抗炎症性脂質であるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）などの多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）が多く含まれるということを明らかにしました。ＰＵＦＡは機能性脂質「脂質メディエーター注７）」の前駆体であり、通常はリン脂質に結合した状態で存在しますが「分泌型ホスホリパーゼＡ₂（ｓＰＬＡ₂）」がこれをリン脂質から切り離すことで脂質メディエーター合成を開始させることが知られています。
一方で近年、炎症やがんにおいては脂質メディエーターの関与が大きいことが知られており、さまざまな疾患へのｓＰＬＡ₂群の関与が注目されています。そこで「ｓＰＬＡ₂がＥＶ膜上リン脂質に作用することで脂質メディエーターが生成され、腫瘍微小環境に多大な影響を及ぼしている」との仮説を立て、ｓＰＬＡ₂研究で国内随一の実績を持つ東京大学 村上グループとの共同研究を行いました。ＥＶを介した物質の輸送に関しては世界中で多くの研究が報告されていますが、その実験系構築の難しさや脂質という領域の複雑さからＥＶの膜脂質に着目した研究はごくわずかです。そのような中で、本研究グループは上記の仮説をもとに、「実際に腫瘍由来ＥＶがｓＰＬＡ２の基質となり得るのか」を皮切りに、両研究グループの強みを生かして、詳細な脂質解析、その生物学的意義および腫瘍形成に及ぼす影響について検討を進めました。
＜研究の内容＞
本研究では、まず血中の免疫細胞をヒトの細胞に置き換えたヒト化マウス注８）を作成し、ＥＢＶを感染させることでマウスにヒトのリンパ腫を自然発生させました。幸谷グループの属する東海大学では、このヒト化マウスモデルを国内最初に作成した実績があり、安定的に作成できました。この腫瘍モデルマウスの腫瘍組織内で発現するｓＰＬＡ２を解析したところ、ｓＰＬＡ２群の中でも強力な活性を持つ「ｓＰＬＡ２－Ｘ」が腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）に高発現していることが明らかとなりました（図１）。
そこでそのｓＰＬＡ２－Ｘと腫瘍由来ＥＶを試験管内で反応させたところ、大量のリン脂質分解産物が検出され、腫瘍由来ＥＶがｓＰＬＡ２に分解されることが証明されました（図１）。またこのときのＥＶを「クライオ電子顕微鏡」で観察したところ、この反応によりＥＶの形状が著しく変化することが世界で初めて観察されました（図２）。
次にそのｓＰＬＡ₂処理ＥＶ（ｓＰＬＡ₂ ＥＶ）の機能についてさまざまな側面からの解析を行いました。その結果、
① ＥＶの古典的作動メカニズムであるマクロファージへの取り込みが促進される
② マクロファージにおけるＴＡＭマーカー発現が著しく増加する
③ 酵素反応によりＥＶから生成される脂質メディエーター分子そのものも①・②の機能を促進する
④ ｓＰＬＡ₂の酵素反応は腫瘍細胞由来・患者血清由来のＥＶで起こり、健常者血清由来のＥＶでは影響が小さい
ことを含むさまざまな現象が明らかとなりました。
一方で、この酵素反応により生成される脂質メディエーターは細胞膜上の「Ｇたんぱく質共役受容体（ＧＰＣＲ）注９）」を活性化することで効果を発揮することが知られています。
ｓＰＬＡ₂ ＥＶでは上記の知見から脂質メディエーターによるＧＰＣＲの活性化の可能性が考えられたため、東北大学 井上 飛鳥 准教授、東京大学 大学院薬学系研究科 青木 淳賢 教授が開発した「ＴＧＦα Ｓｈｅｄｄｉｎｇ ａｓｓａｙ［Ｉｎｏｕｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１２；９］」を用いて解析を行ったところ、ＥＶを取り込む能力のある単球様細胞株ＴＨＰ－１だけでなくＥＶを取り込む能力の無いＴリンパ球系細胞株であるＪｕｒｋａｔでもｓＰＬＡ２ ＥＶによるシグナル増強が確認されました。これは「ＥＶは細胞に取り込まれずとも作用する」というこれまでのＥＶ生物学にはない新規の作動メカニズムが存在することを意味しており、これにより生体内ではｓＰＬＡ２によってＥＶのターゲット層が大幅に拡大し、さまざまな細胞に影響し得ると考えられます（図３）。
次に本研究グループは、そのｓＰＬＡ２ ＥＶの効果を生体において実証するため、炎症モデルマウスにｓＰＬＡ２ ＥＶを投与することで、リンパ腫由来ＥＶが本来持っている抗炎症・免疫抑制効果がｓＰＬＡ２によって増強されるかを検討しました。その結果、脾臓（ひぞう）や肺におけるさまざまな抗炎症効果の増強が認められました（図４）。
さらに本研究グループはＥＢＶ感染腫瘍形成モデルでの検討も行いました。前述の先行研究においては、腫瘍由来ＥＶを投与すると腫瘍形成が促進されるということが報告されていましたが、本研究では通常の腫瘍由来ＥＶではなくｓＰＬＡ２ ＥＶを投与したところ、劇的な腫瘍形成促進効果が確認されました（図４）。また、生体内に存在するｓＰＬＡ２を阻害剤によって抑制すると腫瘍形成が完全に抑制されました。
最後にこの現象が実際にヒトでも起こっているのか検討するために、東海大学医学部付属病院で過去にびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫注１０）と診断された患者の腫瘍組織検体全１００例を用いてヒト腫瘍組織におけるｓＰＬＡ２の発現の有無を調査しました。その結果、ｓＰＬＡ２－Ｘ陽性の患者では悪性度の指標となるバイオマーカーが陰性群より高値を示し、臨床病期も高い傾向が見られ、予後も不良であることが明らかとなりました。
以上の結果をまとめると、腫瘍形成においては腫瘍組織中のＴＡＭより細胞外リン脂質分解酵素ｓＰＬＡ２が分泌されており、これにより腫瘍細胞から分泌されたＥＶの膜リン脂質が分解されると、さまざまな脂肪酸やリゾリン脂質が生成され、ＥＶの形態変化・ＧＰＣＲシグナル増強・取り込みの促進などが誘導され、結果的には腫瘍微小環境の構築が急激に促進され腫瘍形成へとつながることが明らかになりました。一方でこのｓＰＬＡ２－ＥＶ軸を阻害するｓＰＬＡ２阻害剤の投与で腫瘍形成が抑制されたことから、がん治療の新規創薬ターゲットとなることが期待されます（図５）。
＜今後の展開＞
本研究から、悪性リンパ腫の発生および悪化におけるカギ「ｓＰＬＡ２－ＥＶ軸」という新たな免疫チェックポイントの存在が明らかになったことより、今後はリンパ腫組織中のｓＰＬＡ２をターゲットとしたリンパ腫治療薬の開発やバイオマーカーとしての活用などが望まれます。また、ＥＶ膜リン脂質の分解は、他のがん由来のＥＶにおいても起こることが証明されたことから、ｓＰＬＡ２－ＥＶ軸をターゲットとした治療は全がんにおいて有効である可能性も秘めており、今後のさらなる研究が期待されます。
一方でｓＰＬＡ２ が示したＥＶの機能向上効果を治療目的に応用する試みも進められており、幸谷グループでは組織保護作用・抗炎症作用を持つヒト肝細胞由来のＥＶにおいてｓＰＬＡ２がその組織保護・抗炎症効果を飛躍的に向上させることを確認しています。このようにｓＰＬＡ２－ＥＶ軸は腫瘍形成の枠にとどまらず、ｓＰＬＡ２がＥＶの固有の能力を増強するという点でこの特殊なｓＰＬＡ２－ＥＶ代謝物を「ｓＰＬＡ２ Ｒｅａｃｔｅｄ ＥＶ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ；ＳＰＲＥＤｓ」と名付け（特許出願中）、現在は新型コロナウイルス感染症を模した重症肺炎モデルにおける治療効果に重点を置いた検討が進められています。最終的にはＳＰＲＥＤｓを用いた全身性に有効な抗炎症薬の開発につながることが期待されます。
ＥＢＶ陽性リンパ腫モデルマウスで発生した腫瘍組織中のｓＰＬＡ２発現を解析した。脾臓で発生したリンパ腫組織ではＰＬＡ２Ｇ１０＝ｓＰＬＡ２－Ｘが正常脾臓組織；ＥＢＶ（－）に比べて最も高発現だった（図1-1）。また同腫瘍組織の多重免疫染色の結果、ＰＬＡ２Ｇ１０＝ｓＰＬＡ２－ＸはＣＤ１６３陽性細胞＝Ｍ２型マクロファージに発現が認められた（図1-2）。このタイプのマクロファージは免疫抑制型の形質を示すことが知られており、腫瘍細胞に対する周りの免疫細胞の攻撃を抑制する方向に働き、がんの進行を促進する。ゆえに腫瘍随伴マクロファージ（Ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ；ＴＡＭ）とも呼ばれ、腫瘍微小環境の構築に大きな影響を与えることが分かっている。
発現増加が見られたｓＰＬＡ２をＥＢＶ陽性リンパ腫細胞から分泌されたＥＶ（Ａｋａｔａ ＥＶｓ）と試験管内で反応させ、質量分析装置にてリン脂質分解産物を検出した。その結果、ｓＰＬＡ２－Ｘと反応させた場合に分解産物の検出量が増加し、ＥＶが分解されていることが証明された。しかし対照実験のｓＰＬＡ２－ＩＩＤではそのような変化は見られず、少なくともこの条件下では酵素活性を示さなかった（図1-3）。
（図2）ｓＰＬＡ２－Ｘと反応直後に最新技術である「クライオ電子顕微鏡」で形態変化を観察した。この結果、脂質２重膜の内層と外層の間隔が不均一となるような形態（黄色矢印）、いびつな形態（紫色矢印）、ＥＶ膜の一部欠損（赤色矢印）、さらにはＥＶ同士の融合とそれによる数珠つなぎ状の凝集（ピンク矢印、ピンク円）が高頻度に観察された。ＥＶの融合により個々のＥＶの中身は多数のＥＶとで共有され、マクロファージに取り込まれる際には効率よくＥＶの中身が取り込まれることで、通常のＥＶの何倍も強力な影響を与える可能性が示唆された。
（図3）ｓＰＬＡ２処理されたＥＶでは膜融合により複数のＥＶ内包物が一度に取り込まれる（古典的作動メカニズムの強化）。またｓＰＬＡ２処理により発生した分解産物であるリゾリン脂質や脂質メディエーターは細胞膜上のＧＰＣＲを介してシグナルを伝達する。マクロファージにおいては両方の作動メカニズムを介して強力なシグナルが入りＴＡＭ誘導が促進される。他の免疫細胞などでもＥＶの取り込みはできないもののＧＰＣＲシグナルによりさまざまな生命現象を引き起こす。
（図4）マウスに炎症を誘導するため大腸菌由来の毒素リポポリサッカライド（ＬＰＳ）を用いた。このＬＰＳの投与により白脾髄領域（紫色の濃い類円形領域）が増大したが、ｓＰＬＡ２ ＥＶの投与によりそれがほとんど打ち消された（①）。また、この抗炎症効果を肺でも同様に評価したところ、ＬＰＳ投与により肺胞腔の領域に好中球等免疫細胞が著しく増加したが、これもｓＰＬＡ２ ＥＶの投与で打ち消され、ｓＰＬＡ２ ＥＶの全身性に有効かつ強力な抗炎症（免疫抑制）効果が証明された（②）。
次に、そのｓＰＬＡ２ ＥＶを造血系ヒト化マウスを用いたＥＢＶ陽性リンパ腫モデルに投与した時の腫瘍形成促進効果（③）とｓＰＬＡ２阻害時の腫瘍形成への影響（④）を評価した。腫瘍形成促進効果を評価する際には、低力価の感染では腫瘍形成を引き起こさないＥＢＶであるＢ９５－８株を感染させ、そこへｓＰＬＡ２ ＥＶなどを投与した。このときＥＶ投与により腫瘍形成は見られたものの、ｓＰＬＡ２ ＥＶ投与時にはそれよりも急速に腫瘍が形成された。一方で腫瘍組織におけるｓＰＬＡ２阻害効果を評価する際には、感染のみで腫瘍形成を引き起こすＥＢＶであるＡｋａｔａ株を感染させた。このときｓＰＬＡ２阻害剤はウイルス感染時より浸透圧ポンプを体内に留置することで観察している間持続的に投与した。この結果ｓＰＬＡ２阻害により腫瘍形成が完全に抑制された。
＜用語解説＞
注１）細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅ；ＥＶ）
細胞から放出される核を持たない脂質２重膜で囲まれた粒子。がん研究の分野では、ＥＶがさまざまなたんぱく質や核酸を輸送することで、がんの生存や悪性化を促す働きが注目を集めている。
注２）腫瘍微小環境
がん細胞（腫瘍）の周囲を囲む環境のこと。正常組織や免疫細胞、細胞外マトリックス、血管などから構成される。微小環境から腫瘍が栄養の供給を受けるなど、腫瘍と微小環境は相互に影響を及ぼし合っており、微小環境が腫瘍の縮小や増殖にも影響を及ぼすと考えられている。
注３）Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）
２本鎖ＤＮＡをゲノムとして持つヘルペスウイルスの一種。ＥＢＶ関連疾患の多くは悪性リンパ腫などの血液腫瘍だが、まれに胃がんなどの上皮細胞がんも引き起こすことが知られている。本研究課題では腫瘍形成能の強いＡｋａｔａ株とそれに比べて弱いＢ９５－８株の２種類のウイルス株を用いた。
注４）リン脂質
コリンやセリンなどの親水性の分子と疎水性を示す２本の脂肪酸を持つ両親媒性の脂質。細胞膜や細胞外小胞の膜などの生体膜の主要な構成成分として知られている。また親水性分子の種類と２本の脂肪酸の種類からその組み合わせは無数にあり、膨大な数の分子種が存在することが明らかになっている。
注５）分泌性ホスホリパーゼＡ２（ｓＰＬＡ２）
リン脂質に結合する２本の脂肪酸のうちｓｎ－２位と呼ばれる部位には不飽和脂肪酸を結合していることが多いが、ｓＰＬＡ２はその部分を切断しリン脂質から脂肪酸とリゾリン脂質を遊離する酵素である。遊離された脂肪酸とリゾリン脂質は強力な脂質メディエーター注７）へと変換されることが知られていることから、ｓＰＬＡ２は脂質メディエーター合成の律速因子であるとされている。生体においてｓＰＬＡ２はリンパ組織におけるオメガ（ω）－３脂肪酸の遊離を介した獲得免疫へのブレーキや（ｓＰＬＡ₂－ＩＩＤ）、気道上皮における自然免疫リンパ球ＩＬＣ２の活性化促進によるぜんそくの悪化（ｓＰＬＡ₂－Ｘ）など、それぞれ異なる組織分布と基質選択性を示すことで組織固有の生命応答を引き起こすことが知られている。
注６）腫瘍随伴マクロファージ（ＴＡＭ）
マクロファージとは体の中に侵入してきたウイルスや細菌など異物の排除に関与する重要な免疫細胞の１つであり、腫瘍随伴マクロファージは腫瘍組織に浸潤しているマクロファージの総称。主に免疫抑制型の形質を示すＭ２型マクロファージがこれに含まれる。そのため、この細胞の浸潤した腫瘍組織では正常な抗腫瘍免疫が抑制され、腫瘍の進展が促進されることが知られている。
注７）脂質メディエーター
不飽和脂肪酸やリゾリン脂質から派生する機能性脂質で、生理活性脂質とも呼ばれる。一般的にはプロスタグランジンやロイコトリエンなどが有名であり、生体内においては炎症を促進する効果を持つオメガ（ω）－６系脂肪酸（アラキドン酸など）に由来する脂質メディエーターと、反対に炎症を鎮める効果を持つω－３系脂肪酸（ドコサヘキサエン酸など）が互いに拮抗（きっこう）することで、正常な生命活動のバランスが保たれている。一方、リゾリン脂質性の脂質メディエーターとしてはリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が知られている。脂質メディエーターのほとんどはＧＰＣＲを介してシグナルを伝達する。
注８）造血系ヒト化マウス
重症免疫不全マウス（ＮＯＤ／ｓｈｉ－ｓｃｉｄ，ＩＬ－２ＲγＫＯマウス）にヒト臍帯（さいたい）血由来の造血幹細胞を移植したマウス。マウス生体内に生着したヒト造血幹細胞からヒトの血液細胞が再構築されるため、ヒトの造血研究などで有用なツールとして用いられている。
注９）Ｇたんぱく質共役型受容体（ＧＰＣＲ）
細胞膜上に存在する膜貫通型の受容体で、その種類は数百種類にもおよぶ。現在出回っている薬剤の多くがこのＧＰＣＲを介して機能することが知られており、創薬における重要な標的分子であるとされている。
注１０）びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）
Ｂ細胞性悪性リンパ腫の一種。日本においては最も頻度の高い悪性リンパ腫であり、リンパ腫全体のおよそ３０パーセント程度を占めることが知られている。
＜論文タイトル＞
“Secreted phospholipase A2 modifies extracellular vesicles and accelerates B-cell lymphoma”
（分泌性ホスホリパーゼＡ２は細胞外小胞を修飾しＢ細胞リンパ腫形成を促進する）
＜お問い合わせ先＞
＜研究に関すること＞
幸谷 愛（コウタニ アイ）
東海大学医学部 基盤診療学系 先端医療科学 教授
〒259-1193 神奈川県伊勢原市下糟屋１４３
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E-mail：aikotani@k-lab.jp
村上 誠（ムラカミ マコト）
東京大学 大学院医学系研究科 教授
〒113-8655 東京都文京区本郷７－３－１
TEL：03-5841-1431
E-mail：makmurak@m.u-tokyo.ac.jp
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